Introducción
Para algunos autores no existe una sustancia mas importante
que el ADN. Esta idea se basa ppalmente en 3 postulados:
¨ El
primero indica que el ADN contiene dentro de su molécula la información que
determina la estructura de proteínas generadoras universales de las funciones
celulares.
¨ El
segundo indica que el ADN tiene la capacidad de transmitir esta información en
forma hereditaria.
¨ El
tercer postulado indica que esta molécula ha dado la base de todos los procesos
evolutivos que han generado los miles de millones diferentes de formas de vida
que ocupan la tierra desde la existencia de las primeras formas de vida hace 3
o 4 mil millones de años.
El conjunto de instrucciones genéticas esta ubicado en el
llamado genoma: el ADN que codifica estas instrucciones junto con proteínas
necesarias para ejercer su función forman los denominados cromosomas.
Todas las formas de vida están constituidas por células, que
son compartimientos cerrados por una membrana y llenos de soluciones de elementos
de naturaleza química.
El bagaje genético esta organizado en cromosomas, los cuales
están compuestos por ADN y proteínas en estructuras fuertemente comprimidas.
Cada cromosoma esta compuesto por miles de genes, las zonas
funciones del ADN y por otras zonas no codificantes. Cada gen es la unidad
funcional mas pequeña y contiene la información para la síntesis de una
proteina.
La función de generar un organismo ha sido asignada a las
células germinales. Estas son capaces de reducir el numero de cromosomas a la
mitad por una división celular llamada meiosis. Los productos de la meiosis son
células haploides llamadas gametas. Estas células presentan una sola copia de
los cromosomas autosomicos y uno de los cromosomas sexuales.
Las gametas se combinan para formar una célula única
diploide con capacidad para generar 10 billones de células constituyentes del
organismo.
La división celular de estas células somáticas mediante los
procesos de mitosis aseguran la transmisión de la información genética
existente en el ADN.
La unidad de un tejido es la célula, de tal manera que en el
mal funcionamiento de las células de un tejido da lugar al mal funcionamiento
del órgano al cual pertenece dicho tejido.
Ciclo Celular
Cada célula esta capacitada para duplicar su material
genético, mediante la duplicación del ADN, y luego dividirse para formar
células hijas. Estas mismas células a su vez tienen la capacidad de generar la
formación de proteínas también a partir del ADN. Estos procesos denominados
duplicación de ADN o duplicación del material genético y transcripción o
generación del intermediario (ARN) para la síntesis de proteínas se realiza en
etapas del ciclo denominado Ciclo Celular.
Se denomina ciclo celular al conjunto de etapas que sigue la
célula durante su crecimiento y división.
La mayoría de los componentes de una célula se sintetizan
durante la Interfase. Este es el periodo entre divisiones y ocupa el 90% del
ciclo. La primera parte de la interfase se denomina G1, proviene de
gap que significa interrupción o suspensión de la continuidad (en este caso
primera interrupción), le sigue la fase S, en la cual hay síntesis de ADN y G2
o segunda interrupción. En G1 hay un crecimiento rápido con una gran
actividad metabólica, que incluye síntesis de ARN y de proteínas. El periodo de
crecimiento celular continua en la fase S y es aquí cuando se duplica el ADN.
En la fase G2 la célula continua su crecimiento y prepara la célula
para su división. La división celular en si
misma, o sea, la mitosis se conoce como fase M. Las células que no se
dividen por periodos largos de tiempo, no tienen duplicación de ADN y se las
considera en periodo de reposo, o sea en periodo G0. Los oncogenes
actúan acelerando la velocidad de crecimiento celular en la fase G1
y pueden llegar a provocar que la célula proceda a una mitosis en vez de hacia
la fase G0. los genes supresores de tumor pueden actuar como señales
de freno en G1 para frenar o desacelerar el ciclo celular antes de
la fase S. A lo largo de todo ciclo celular los genes que codifican para
enzimas reparadoras de ADN pueden estar activos, y particularmente lo están en
la fase G2 después de la
duplicación de ADN, antes que los cromosomas estén listos para la mitosis.
Esquema del Ciclo Celular
La programación de las células eucariotas a través del ciclo
celular esta gobernada por una formación, Activacion y desactivación de un
complejo enzimático de proteínas quinasas denominadas ciclinas (cdk).
Las entradas a las diferentes fases o etapas del ciclo
celular esta regulada por la Activacion y también por la regulación negativa
del complejo cdk. Esta regulación tiene principalmente un fin, que no se
prosiga en el ciclo sin haber sido completada la fase correspondiente
produciéndose todos los eventos moleculares necesarios. A estos ptos de
regulación se los denomina “check points”. Dentro de estos, uno de los mas
estudiados y documentados es aquel que monitorea la terminación de la síntesis
de ADN y la formación del huso funcional actuando en la transición de G2
a M y en la salida de la mitosis. Por ejemplo, en algunos sistemas cuando el
ADN no esta replicado se inhibe la Activacion del complejo cdk por inhibición
de la defosforilacion de una proteina quinasas la ciclina b-cdk2. Esta quinasa
cuando esta fosforilada en una tirosina en la posición 15 activa el complejo y
regula la transición de la fase G2 a M.
Este mecanismo de regulación negativa requiere la Activacion
de varios genes que finalmente dan lugar a la Activacion de una quinasa
denominada Wee 1- MlK-1, la cual es la encargada de mantener fosforilada la
tirosina.
Existen check points en las etapas tempranas del ciclo
celular que controlan la entrada a la fase S.
Todos estos eventos están regulados por la acción de
factores de origen proteico actuando a través de sus receptores de membrana.
Hay diversos factores que interviene, entre los que se encuentran los factores
de crecimiento y las Citoquinas. Podemos definir a los factores de crecimiento
como polipéptidos que estimulan o inhiben la proliferación celular, en tanto
que las citoquinas son reguladoras de la inflamación y la rta inmune. Ambos
actúan a través de receptores de membrana de alta afinidad. Muchos factores de
crecimiento también tienen efecto en migración celular, formación de la matriz,
diferenciación y apoptosis.
Un numero elevado de factores de crecimiento entre los
cuales se encuentran el EFG, factor de crecimiento fibroblastico (FGF), PDGF,
factor de crecimiento de macrófagos (CSF) y los factores de crecimiento
insulino-símiles estimulan la mitosis celular por interacción con receptores de
membrana.
La mayoría de los factores de crecimiento cumplen su función
modificando la actividad de enzimas por reacciones de fosfo-desfosforilacion.
El receptor de insulina tiene actividad de tirosina quinasa.
O sea que la primera fosforilación en
el mecanismo de acción de los factores de crecimiento es la fosforilación en
tirosina de enzimas. Esta fosforilación iniciara la cascada de eventos que dan
lugar a la regulación del complejo enzimático de las ciclinas.
Los receptores presentan en su constitución proteica un
domino extracelular que reconoce a los factores de crecimiento que esta ligado
por un dominio orientado de citoplasma a otro dominio que posee el sitio
catalítico de la actividad de tirosina quinasa. En esta flia de receptores se
pueden distinguir 3 tipos. El receptor tipo I tiene como representante al EGF.
En el tipo II están presentados los factores de crecimiento insulino-símiles y
en los del grupo III PDGF y los oncogenes c-fms que codificarían proteínas
relacionadas a este receptor.
Estos receptores son componentes claves para el control del
crecimiento y diferenciación celular por su habilidad de generar señales
mitogenicas. A su vez estas señales proporcionan y están encuadradas como
llaves para el entendimiento de los procesos de transformación celular. Por
ejemplo, un incremento en la expresión de una subclase de receptores para
factores de crecimiento con actividad de tirosina quinasa, debido a una
amplificación deben la expresión de su gen, da como resultado el crecimiento de
células malignas aun en humanos.
El mecanismo exacto por el cual los factores de crecimiento
pueden regular el crecimiento y diferenciación celular es motivo de numerosas
investigaciones. Dentro de estas hipótesis existe la regulación de la fosforilación
de una proteina ribosomal denominada S6 como uno de los probables gatillos para
que se produzca la iniciación de la síntesis de ADN.
El/los mecanismo/s de acción de factores de
crecimiento/citoquinas en la estimulación de la proliferación celular es muy
compleja. La mayoría se une a receptores transmembrana que tienen actividad de
tirosina quinasa en algún dominio o se une a una tirosina quinasa Src-símil
como Jak o Tyk. Cuando el factor se une al receptor produce una
transfosforilacion del receptor en tirosina. Esta tirosina fosforilada sirve de
soporte a enzimas citosolicas o moléculas adaptadoras las cuales a su vez se
fosforilan en tirosinas y se activan desencadenando mecanismo de señales de
transducción para cambios en forma celular, diferenciación o proliferación. Los pasos de proliferación
pueden incluir moléculas adaptadoras como Shc o Grb2, las cuales producen
un incremento en el GTP unido a Ras,
Activacion de Raf y estimulación de la cascada de quinasa de serina-treonina
MAP, la cual culmina con la fosforilación de factores de transcripción.
Un mecanismo alternativo incluye la fosforilación de
factores de transcripción por receptores e involucra la fosforilación de STAT
(transductores de señales y activadores de transcripción). Las proteínas STAT
se conoce que una vez fosforiladas migran al núcleo para unirse al factor de
transcripción “secuencias activada
gamma” (GAS); este mecanismo, muy complejo de señales inicia el ciclo celular
muy temprano en la fase G1, para avanzar en la progresión del ciclo celular
siendo regulado por las CDKs.
La ausencia de estos factores de crecimiento hace que las
células se detengan en la fase temprana de G1 llamada también G0.
El factor inhibidor del crecimiento denominado TGF beta o “growth inhibition transforming
factor” inhibe la entrada de las células a la fase G1. Este factor
trabajando también a través de la Activacion de receptores de membrana genera
las señales necesarias para inhibir la Activacion del complejo ciclina o
“ciclin complex”. Este mecanismo se produce por la inhibición de la expresión
de una de las enzimas del complejo denominada cdk4.
Existe otra proteina denominada Cip 1 que inhibe el complejo
cyclin-cdk, que es inducida por otra proteina denominada p53 a cuyo gen se lo
denomina “gen supresor”.
De este modo, la maquinaria para el ciclo celular es un pto
de convergencia intracelular de señales de crecimiento en la fase G1.
Una vez iniciada la cascada de señales de transducción por los receptores
tirosina quinasa, progresa la acción, controlada ahora por las CDKs.
Estas CDKs están presentes en todo el ciclo celular y su
actividad es regulada por ciclinas que las activan y por inhibidores de CDKs.
Las ciclinas CDKs e inhibidores de CDKs son responsables de la regulación de la
progresión de G1 a S del ciclo celular.
La ciclina tipo D se expresa en la fase media de G1 y une
CDKs; una vez fosforilado este complejo holoenzimatico por CAK (quinasa
activadora de CDK) se activa para fosforilar otras proteínas incluyendo Rb. La
ciclina D1 es idéntica a los oncogenes bc11 y PRAD1. La ciclina D2 se comprobó
su identidad con el oncogen Vin-1. La ciclina E se expresa en la fase G1
tardía, une CDK2 la cual es activada por CAK y fosforila Rb (Rb es el gen
supresor de retinoblastoma).
Los inhibidores de CDK son reguladores importantes de la
actividad de CDK2 y CDK4. Otras proteínas (INK4, p16MTSI/INK4A y p15MTS2/INK4B)
representan genes supresores de tumor que están deleccionados en muchos
canceres e inhiben el complejo ciclina D-CDK2. otros inhibidores de CDK tienen
una especificidad muy amplia inhibiendo la actividad de ambos complejos de
ciclinas: D-CDK4 y E-CDK2; estos son p21WAF1/CIP1, que se induce por
el gen supresor de tumor p53 como rta al daño de ADN, y p27KIP1. Ha
sido demostrado que Rb es un blanco estratégico de señales regulatorias que
gobiernan la transición G1/S
en muchos tipos celulares. Cuando Rb se encuentra como proteina no fosforilada
en G1 es activa como supresora de crecimiento y esta actividad esta
vinculada a su capacidad de unir proteínas de la familia del factor de
transcripción E2F. En la fase G1 tardía la pRb esta hiperfosforilada
y se libera E2F, lo cual activa la transcripción de genes que se requieren para
la transición G1/S, y para la síntesis de ADN. Además de pRb hay
otras 2 proteínas pRb-símiles, p107 y p130, recientemente identificadas que
también regularían el crecimiento durante la fase G1 y son blanco de
fosforilaciones especificas en el ciclo celular por quinasa dependientes de
ciclinas.
Estos reguladores nucleares de la progresión del ciclo
celular son potenciales puntos clave para una terapéutica en cáncer. Todos
estos puntos de control del ciclo son importantes para el mantenimiento de la
integridad genomica. Estos genes integran un sensor de las condiciones del entorno
para una adecuada rta ante un daño en el ADN; estos mecanismo están
frecuentemente deteriorados en células cancerigenas y se manifiesta como la
alta inestabilidad genomica que presentan. Aunque esta inestabilidad genomica
no necesariamente significa que se generaran estos eventos malignizantes, sí
incrementa mucho la posibilidad de que ocurran , a través de inactivacion de
genes supresores y de la Activacion de oncogenes, ya que la malignizacion
celular es un proceso de muchos pasos que da lugar a una gran heterogeneidad
celular.
Si bien las células mamíferas tienen muchos mecanismo para
mantener la integridad genética, cuando se alteran estos pasos en cáncer da
lugar a las metástasis y resistencia a
las drogas. Estos fenómenos se inician cuando la célula sufre un daño en su ADN
ya sea provocado por procesos endogenos o exógenos, lo cual altera su
estructura, la progresión del ciclo celular se frena mientras el daño del ADN
se repara o la célula es eliminada por apoptosis. En las células en las cuales
hay mutaciones que alteran los pasos de detección, reparación o rta al daño de
ADN, el ciclo celular no se frena, se producen alteraciones cromosomicas que
activan oncogenes o inactivan genes supresores de tumores.
Estructura y Función del ADN
Cada molécula de ADN contiene dos cadenas de nucleótidos,
compuestos de un azúcar (desoxirribosa), grupo fosfato y 4 bases nitrogenadas:
A, C, T y G.
Una cadena de ADN se forma por la union de los nucleótidos
en forma covalente y se realiza entre el OH del azúcar y el grupo fosfato una
union fosfodiester.
Las dos cadenas se complementan entre si como imágenes
espejo y se encuentran interaccionando entre ellas por enlaces pte de H que son
uniones no covalentes. (C-G y A-T).
Se puede decir entonces que el ADN esta formado por dos
polímeros de nucleótidos, cada uno formado por uniones covalentes de
nucleótidos. Estos polímeros esta unidos entre si por uniones no covalentes enfrentándose en forma de
imagen especular.
La estructura final del ADN fue conocida en 1953 por Watson
y Crick, quienes diseñaron el modelo tridimensional del ADN que es aceptado
actualmente.
Este modelo propone que el azúcar y el grupo fosfato están
mirando hacia fuera de la estructura tridimensional de doble hélice y las bases
hacia adentro de ella.
La secuencia completa de ADN en todos los cromosomas de una
especie se denomina genoma. El genoma humano normal se compone por 23 pares de
cromosomas: 22 pares autosomicos y un par de cromosomas sexuales (X e Y).
La parte central del cromosoma se denomina centrómero y
separa los dos brazos: el corto denominado p y el largo denominado q.
Durante la gametogenesis las células diploides producen
células haploides a través de dos divisiones celulares especiales en un proceso
denominado meiosis. Cada célula germinal haploide que resulta de la meiosis
contiene uno de cada uno de los 22 pares de cromosomas autosomicos y un
cromosoma X o Y. En la fertilización se fusionan un espermatozoide y un ovocito
para formar una célula diploide normal. La cigota se replica en sucesivas
divisiones mitóticas, en las cuales todos los cromosomas son replicados en cada
una de las células de la descendencia, por esto si una mutación esta presente
en el espermatozoide o en el ovocito que dieron lugar la célula cigota, cada
célula de nuevo ser contendrá esa
mutación. En este fenómeno se basa la transmisión de mutaciones que predisponen
a enfermedades hereditarias. Es importante comprender que un gen puede tener
distintas formas o variaciones en su secuencia de ADN en los individuos de una población.
Esas formas o variantes del mismo gen se llaman alelos.
En la meiosis los pares de cromosomas se separan, de modo
tal que un óvulo o un espermatozoide tiene solo un alelo de cada par. Cuando
las dos células germinales se fusionan, la descendencia tendrá dos copias para
cada alelo. Si la descendencia hereda dos alelos del mismo tipo, se la
considera homocigota para ese alelo, si en cambio, los alelos heredados son
distintos se la considera heterocigota para ese alelo. Esta herencia de genes
se la conoce como segregación alelica.
Duplicación del ADN
La duplicación del ADN es un proceso que se realiza antes de
la división celular e involucra la polimerización de los diferentes
nucleótidos.
Esta replicación se realiza por un complejo multienzimatico donde
intervienen enzimas y proteínas sin actividad enzimatica.
La duplicación es un proceso en el cual una secuencia de
nucleótidos del ADN es copiada, sintetizándose dos cadenas complementarias con
nucleótidos con bases complementarias.
Este proceso necesita que un nucleótido no polimerizado aun,
reconozca su complementario en la cadena con nucleótidos ya polimerizados. Para
que ello ocurra se necesita que se separen las cadenas. Este mecanismo permite
el enfrentamiento de los nucleótidos no polimerizados con sus complementarios.
Este proceso permite el inicio de la polimerización.
Para comenzar la apertura de la hélice actúa una enzima
llamada helicasa (topoisomerasa II), que utiliza ATP para poder actuar a lo
largo de la cadena.
La hélice a pesar de estar formada por interacciones no
covalentes es muy estable, es por ello que para abrir dicha hélice mediante la
acción de la enzima helicasa, son necesarias además, unas proteínas llamadas
“proteínas desestabilizantes” o SSB.
Estas proteínas se ubican como en caravana a lo largo de la
cadena de nucleótidos de una forma muy particular, dejando libres las bases de
nucleótidos para que puedan ser reconocidos por las bases de los nucleótidos
que se complementaran y formaran la nueva cadena.
A medida que la hélice se desenrolla comienza a existir una
presión por delante de la abertura que hace girar al ADN. Este giro requeriría
gasto de energía para que no se produzca la ruptura de las hebras de ADN. Para
evitar este fenómeno actúa una enzima que sigue a la abertura de la hélice
denominada topoisomerasa; esta tiene como función romper y reparar las uniones
fosfodiester y así evitar el giro. A esta enzima se la denomina nucleasa
reversa. De esta forma se desarrolla el ADN y permite que actúe la enzima
polimerizante.
La polimerización del ADN se origina en sitios llamados
regiones de origen, en los cuales actuarían algunas proteínas poco
caracterizadas llamadas proteínas de iniciación que indicaría el punto de
origen para el comienzo de la acción de la helicasa y la polimerasa.
La polimerización se realiza por una enzima llamada ADN
polimerasa que usa como sustratos a los desoxinucleotidos trifosfatos.
Cada cadena es copiada formándose cuatro cadenas, donde dos
de ellas ya están previamente polimerizadas y son las llamadas cadenas molde o
templados, a este proceso de duplicación se lo llama semi-conservativo.
Las cadenas de ADN están enfrentadas de manera tal que el
comienzo de una cadena de polímeros tendrá un extremo 3´ del azúcar y en el
otro extremo 5´. La cadena que se enfrenta y es complementaria, tendrá en el
extremo 3´de la primera cadena, el extremo 5´ y en el otro extremo 5´ tendrá el
3´. En otras palabras las cadenas de polímeros van en dos direcciones una de 3´
a 5´ y la otra de 5´ a 3´. Es por ello que se las denomina antiparalelas.
La ADN polimerasa solo puede polimerizar en sentido 5´-3´.
Ello representa que una cadena se puede copiar directamente pero la otra
necesitara de un polímero pequeño de ADN que se denomina primer o iniciador. La
ADN polimerasa usa como soporte para polimerizar los desoxinucleotidos a este
primer.
Este pequeño polímero esta formado por la acción de una
enzima llamada ARN polimerasa ADN
dependiente.
Los desoxinucleotidos que se van a polimerizar por la acción
de la ADN polimerasa, luego de la síntesis del cebo, se formarían en
fragmentos. Este fenómeno fue descubierto por Okasaki, de allí que los
fragmentos se denominen fragmentos de Okasaki. De manera tal que una de las
cadenas estará copiada en fragmentos a los cuales se los debe unir y además
eliminar los pequeños ribonucleótidos usados de cebo.
La síntesis de ADN
se inicia normalmente en muchas regiones llamadas puntos de origen de
replicación y los mismos se encuentran en cada cromosoma. La iniciación de esta
síntesis esta controlada por la Activacion de las proteínas quinasas
dependientes de ciclina. La replicación
se origina en diferentes sitios pero además cada origen de iniciación se
activa a diferentes tiempos en regiones del cromosoma que se organizan en el
espacio en forma de clusters dentro del núcleo. La replicación se produce solo
una vez por el ciclo celular, o sea que se origina de una sola copia los
cromosomas y no se producen nuevos sitios de origen de replicación hasta no
haber finalizado el ciclo.
En los sitios donde se generan sitios de origen,
generalmente se encuentran en la secuencia del ADN regiones ricas en A/T.
Existen unas secuencias llamadas ARS-binding factor (ABF-1), luego se
identificaron dos complejos denominados ORC que esta formado por 6 polipéptidos
y se denomina multiprotein origin recognition complex. Otra proteina descripta
involucrada en los mecanismos de iniciación es la denominada replication
protein A. Es una proteina que es fosforilada durante la fase S del ciclo
celular por Activacion de las quinasas dependientes de ciclina.
Cual es la señal que da lugar a la interacción de este tipo
de proteínas con el ADN? Aparentemente durante la mitosis se produciría la
permeabilizacion de la membrana nuclear para dar lugar a la penetración en el
núcleo de un factor denominado “licensing factor” necesario para que se
produzca la union de los complejos proteicos con secuencias de ADN y dar lugar
a la formación de nuevos y múltiples sitios de iniciación.
La enzima o los complejos enzimáticos que finalmente dan
lugar a la replicación del ADN son los formados por unas enzimas llamadas ADN
polimerasas. La función de estas enzimas es la de adicionar nucleótidos para
formar una cadena de ADN, comenzando por un pequeño grupo de nucleótidos o base
llamado primer. A su vez tienen la capacidad de reparar un error cambiando un
nucleótido incorporado erróneamente.
Se han realizado estudios estructurales en dos polimerasas,
una denominada Fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. Coli y la
transcriptasa reversa del virus HIV-1 del SIDA.
La ADN polimerasa de Klenow normalmente usa como templado al
ADN. La transcriptasa reversa puede usar ADN o ARN. Ambas enzimas tienen
asociado un dominio que presenta actividad de nucleasa, pero este dominio tiene
funciones diferentes en ambas enzimas. En la Klenow la región de nucleasa sirve
para reparar errores en la introducción de nucleótidos. Mediante este sitio la
polimerasa saca el nucleótido erróneamente agregado por la misma enzima. Es una
actividad de 3´-5´exonucleasa. En el caso de la transcriptasa reversa esta
actividad de nucleasa sirve para romper la union entre el ARN que usa como
templado y el ADN sintetizado. También son diferentes en su estructura 4ª. La
Klenow es un monómero y la transcriptasa reversa es un dimero formado por
subunidades de diferente tamaño.
La estructura de la Klenow muestra que es una proteina
constituida por dos dominios bien definidos. Uno largo c-terminal conteniendo
una hendidura o hueco y otro mas pequeño globular en el amino-terminal. La
actividad de exonucleasa esta localizada en el dominio amino-terminal, mientras
que el sitio activo de polimerasa se encuentra en el dominio c-terminal. Este
sitio a su vez puede ser dividido en 3 dominios denominados “palm, fingers y
thumb”. El subdominio palm contiene estructura de hoja beta plegada y contiene
al sitio catalítico. El subdominio fingers esta compuesto por estructuras de
alfa hélice y el dominio thumb contiene dos cadenas alfa hélice paralelas de
gran longitud. Se han descripto además lugares de interacción o binding sites
para metales divalentes en la región de exonucleasa como así también en la
región catalítica de polimerasa. Los iones que interaccionan son de Mg, Mn o
Zn.
La estructura de la transcriptasa reversa, la cual puede
emplear ADN o ARN como templado dando híbridos de ADN-ARN o duplicados de ADN,
se puede presentar como un heterodímero formado por una subunidad de 66 kDa y
una de 51 kDa, encontrándose la actividad de polimerasa en la subunidad de 66
kDa. Esta transcriptasa tiene un dominio con actividad de ARNasa denominado
ARNasa H y esta localizado en un dominio separado de la actividad de polimerasa
y localizado en la región c-terminal.
El sitio activo de ambas polimerasas esta localizado en la
región denominada palm, contiene el sitio catalítico, la región que une por el
sitio 3´ terminal la cadena donde se van polimerizando los nucleótidos también
denominada primer. Esta región contribuye a la union del nucleótido a ser
agregado. Esta región es la mas conservada de todas las polimerasas.
La nomenclatura de las ADN polimerasas se puede encontrar
indicado con letras griegas por ejemplo, ADN polimerasa a, d y e, también conocidas como polimerasas I, II y
III, respectivamente. Existen otras ADN polimerasas descriptas, por ejemplo b, en levaduras, aunque su acción no seria en
los procesos de replicación sino mutagenesis, haciendo by pass en los sitios
damnificados del ADN.
De todas las ADN polimerasas en eucariotas, la delta es la
mas conservada desde levaduras a humana. Las polimerasas también tienen
actividad de exonucleasas, en el caso de la polimerasa delta ambas actividades
residen en la subunidad de mayor tamaño.
La polimerasa epsilon humana también tiene dos subunidades,
pero en este caso la subunidad catalítica tiene 225 kDa y la restante 50 kDa.
Su función es desconocida. Esta polimerasa tiene su acción principalmente en la
reparación de ADN, sin embargo, esto no descarta que a su vez actúe en los
procesos de replicación. Esta polimerasa también interviene en el control de
los check points en la fase S, actuando como sensor para la replicación,
transmitiendo señales inhibitorias para prevenir procesos transcripcionales
inapropiados durante esta fase del ciclo celular. Estas dos funciones residen
en diferentes dominios de la proteina; en el amino terminal se encuentra la
actividad de polimerasa y en el carboxilo terminal la función de control de
check point.
La distribución de las polimerasas es asimétrica y se sabe
que los errores en la replicación pueden estar inducidos por error en la distribución
de las proteínas o concentración de nucleótidos en estos sitios.
En los últimos años se han descripto una serie de factores
accesorios a las ADN polimerasas que pueden dividirse en tres grandes clases:
a) proteínas que se unen al ADN como cadena simple; b) factores de
reconocimiento entre el templado (cadena de ADN) y el iniciador o primer y c)
factores de procesamiento. Dentro de estos factores se puede mencionar una
proteina denominada RP-A, cuyo equivalente en levadura es RV-A. Esta compuesta
3 subunidades y es requerida tanto para la iniciación como para la elongación
de la cadena de ADN. Esta proteina es fosforilada y la fosforilación en al
menos una de sus subunidades tiene un papel fundamental en este proceso.
Otro factor es el llamado PCNA y su papel es esencial
durante la replicación del ADN. Esta identificado como un factor auxiliar de la
polimerasa delta. Este factor interacciona con una proteina denominada p21, que
es un inhibidor de la proteina p53, proteina relacionada a los genes supresores
y relacionadas a la cascada de las proteínas quinasas dependientes de ciclinas.
Otro factor el RFC (llamado factor de replicación C) es una
proteina que une ATP y tiene actividad ATPasa, siendo esta actividad máxima
cuando se produce la interacción del iniciador o primer con el templado.
Expresión de la Información Genética
La expresión de la información genética involucra la
traducción de una secuencia lineal de nucleótidos de ADN en una secuencia
colineal de aa.
La copia del ADN dando lugar al ARNm se denomina
transcripción y la copia del ARNm en una secuencia lineal de aa se denomina
traducción.
La translación de la secuencia nucleotidica de ADN en
proteínas se basa en un código de triplete de nucleótidos.
Cada triplete, llamado codon, codifica para un único aa;
existiendo 4 bases y expresándose como tripletes se forman 64 (43)
posibles codones para codificar solo 20 aa, o sea que para cada aa hay mas de
un codon, esto se denomina código redundante.
Algunos de los codones tienen funciones especiales: AUG
codifica para metionina e inicia la traducción de todas las proteínas, hay 3
codones de finalización de traducción que son UAA, UGA y UAG.
ACIDOS
RIBONUCLEICOS (ARN)
La transcripción da lugar a la formación de tres tipos de
ARN, mencionados el mensajero, el ribosomal y el de transferencia.
Los ARNs son de simple cadena y las bases que los
constituyen son: adenina, guanina y citosina; uracilo.
Las moléculas de ARN se sintetizan en el núcleo (algunas
formas se sintetizan en la mitocondria) y son exportadas al citoplasma,
mientras que las proteínas que tienen función
en el núcleo se sintetizan en el citoplasma y son importados al núcleo.
El núcleo esta cerrado por una envoltura que consiste en un
par de membranas concéntricas. La membrana externa se continua con la membrana
del RE y el espacio perinuclear, entre la membrana externa y la interna se
continua el lumen del RE.
El intercambio de los materiales se realiza a través de los
poros nucleares.
ARNm
El ARNm es tipo especial de ARN en el cual la secuencia
nucleotidica del mismo es complementaria a una de las cadenas del ADN. Existen
en el ARNm un conjunto de tripletes de nucleótidos llamado codon que provee la
información especifica para reconocer un aa.
ARNt
Estos ARNs son pequeñas moléculas cuya función es la de
actuar como transportadores intracelulares de los aa hacia los ribosomas como
síntesis proteica. De los 20 aa que se encuentran en las proteínas, cada uno de
ellos tiene por lo menos un ARNt que lo transportara específicamente. Algunos aa
pueden ser transportados por mas de un ARNt.
ARNr
Al ARN ribosomal constituye cerca del 65% de la masa
ribosomal. En células eucariotas
existen 4 tipos de ARNr, cada uno identificado, cada uno identificado por su
coeficiente de sedimentación como 5S, 7S, 18S y 28S.
transcripción
El ARNm es traducido a una proteina en una serie de
reacciones catalizadas por un gran complejo llamado ribosoma.
Los aa utilizados para formar la proteina son transportados
hacia el ribosoma por el ARNt que representaría el lápiz siguiendo el ejemplo
grafico.
Los ARNt presentan una estructura tal que cada 3 nucleótidos
del ARNm existen en el ARNt otros 3
nucleótidos que se reconocen en forma complementaria. Este reconocimiento se
realiza a través de las bases de ambos ARN.
Para que se produzca la expresión de estos genes en forma
especifica y diferencial existen unas unidades denominadas de y tanscripcion,
que dan lugar a la formación de transcriptos específicos llamados transcriptos
primarios.
La unidad de transcripción es una región del gen que
contiene una señal para la generación del transcripto primario. Principalmente esta unidad de transcripción debe contener un sitio de
iniciación y uno de terminación de la transcripción. El producto de esta unidad
de transcripción son los ARNs que darán lugar a la síntesis proteica.
Un fragmento de ADN que servirá para que finalmente se
sintetice una proteina, previa formación del ARNm, esta formada por varias
regiones cada una con una función especifica a saber:
1)
Una región de control
A la misma se le atribuye la función de controlar el
incremento de la transcripción. Estas secuencias de control tienen
características muy interesantes como por ejemplo:
-
Están formadas por 300 a 500 pares de bases con secuencias
repetitivas en su cadena con independencia funcional.
-
Pueden actuar a distancia del sitio de iniciación.
-
No necesariamente se encuentran por delante del sitio de
iniciación de la transcripción.
Estas dos secuencias están involucradas en la union e
iniciación de la transcripción.
3)
El punto de iniciación de la transcripción
Este punto depende de la presencia de un promotor. La
función que cumpliría el promotor seria señalar el punto de inicio de la
transcripción.
4)
Los exones
Son secuencias de nucleótidos que darán lugar a la
transcripción de los nucleótidos con bases complementarias para la formación
del ARN.
5)
Los intrones
Estas secuencias se hallan intercaladas entre las secuencias
codificantes. Estas secuencias también son transcriptas pero luego se pierden
en la etapa de maduración del ARNm.
6)
Una secuencia AAUAAA, un punto de poliadenilacion y una señal
de terminación
Inmediatamente terminada la transcripción una enzima
denominada poliA-polimerasa efectúa un corte y poliadenilacion del extremo 3´, usando
ATP como sustrato. Esta enzima agrega entre 100 y 200 residuos de ácido
adenilico. Esta adición esta dirigida desde el lugar donde se halla la
secuencia AAUAAA. La eliminación o mutación de esta secuencia evita la
poliadenilacion. La poliadenilacion se realiza antes de que el ARN salga del
núcleo.
Todavía no se conocen los mecanismos de terminación de la
transcripción o cuales serian las secuencias que determinan que la enzima
encargada de la síntesis de ARN (polimerasa) se desacople de la unidad de transcripción.
En las células de organismos eucariotas se han encontrado 3
tipos diferentes de polimerasas. Cada una de estas polimerasas son enzimas
encargadas de sintetizar un tipo de ARN. La polimerasa llamada de tipo I es la
encargada de catalizar la transcripción del ARNr. Se encuentra en el nucleolo y
es la encargada de producir alrededor del 50 al 70% de la transcripción
nucleolar total.
La polimerasa tipo II que se halla en gran parte asociada a
la cromatina es la responsable de la formación del ARN precursor del mensajero.
Este ARN precursor también se denomina heterogéneo. El tercer tipo de
polimerasa tipo III es la encargada de sintetizar ARN pequeños incluyendo la
fracción 5S del ribosoma.
En el proceso de transcripción para que se produzca la síntesis
de ARN por apareamiento de nucleótidos por intermedio de sus bases, en primer
termino se deben separar las cadenas de ADN. Ello sucede en el punto de union
de la ARN polimerasa y requiere la presencia de una secuencia determinada de
nucleótidos que como describimos anteriormente se denomina promotor. Luego se
produce la elongación de la cadena de ribonucleótidos, donde los mismos son
adicionados por acción de la polimerasa, formándose uniones covalentes
adicionándose a partir de la cadena por el extremo 3´avanzando la polimerasa en
sentido 3´-5´. Por delante de la polimerasa las hebras de ADN se van
desenrollando y por detrás de la polimerasa se van enrollando. Cuando la
polimerasa reconoce el sitio de union de terminación se agrega el ultimo ribonucleótido
y el transcripto se desacopla liberándose la polimerasa y volviendo el ADN a su
configuración original de doble cadena en forma helicoidal.
Cuando se conocieron los mecanismo de transcripción y
traducción se planteo la interrogante de cual fue la primer molécula existente
el ARN o el ADN, dado que para el inicio de la síntesis de proteínas se
necesitan enzimas y las enzimas son proteínas.
En experimentos muy recientes se ha comprobado que el ARN
puede presentar actividad enzimatica, sobre todo para la formación de los
enlaces entre aa. De ahí que se haya elaborado la siguiente hipótesis para la
explicación de la aparición de los organismos.
Se postila que aparentemente se sucedieran una serie de
eventos que, en la secuencia del tiempo, se pueden exponer en 4 etapas:
1)
Formación de polímeros de ARN capaz de dirigir su propia
replicación.
2)
Desarrollo del mecanismo por el cual el ARN de lugar a la
síntesis proteica.
3)
Formación de una membrana lipidica que contenga a la mezcla de
ARN y proteínas.
4)
Desarrollo del mecanismo por el cual se forme el ADN capaz de
conservar la información que transmitía el ARN y de esta manera conservar la
información y la especie ante cualquier destrucción de los ARNs.
Resulta fundamental para el entendimiento del funcionamiento
de un organismo tener el conocimiento de los elementos que dan lugar a la
duplicación del ADN, a la transcripción con formación del transcripto primario
y se realiza antes de que los mismos abandonen el núcleo. El primer proceso es
la adición en el extremo naciente de un 7-metilguanilato. Esta adición se
realiza con una union 5´-5´trifosfato.
A este proceso se los denomina adición de la caperuza o
camping.
El segundo proceso es el de poliadenilacion y extracción de
las secuencias no codificadas transcriptas por los intrones. A este proceso se
lo denomina “de corte y empalme o splicing”.
El mecanismo de corte y empalme en el ARNr lo realiza el
propio ARN. En este proceso no intervienen enzimas y se conoce que el propio
ARN tiene la capacidad de realizarlo sin gasto de energía con ganancias y
perdidas de uniones fosfodiester.
El ARNt también sufre el proceso de corte y empalme, pero a
diferencia del ribosomal, este proceso se realiza por acción de una
endonucleasa. Esta enzima realiza dos cortes en el extremo de intron
transcripto para luego actuar una ligasa y unir los dos extremos.
El ARNm es acortado en forma diferente y por un proceso que
involucra a ribonucleoproteinas. Estas se unen por complementariedad de bases a
secuencias conservadas entre los nucleótidos transcriptos por intrones y
exones. Como paso intermedio en esta reacción se forma una estructura en forma
de lazo en la cual el extremo 5´ se pliega sobre si mismo cerca del extremo 3´.
Estas secuencias que se localizan en los puntos de corte serian las principales
determinantes de los puntos de corte y empalme. Se denominan secuencias
consensuales y son las secuencias que se conservaran en la mayoria de los
genes. La mutación de una de estas secuencias llevara a la síntesis proteica
anormal.
Uno se podría preguntar porque se transcriben los intrones
si luego en el proceso de maduración se cortan y solo se empalman los exones.
Pues bien, no todos los intrones transcriptos se cortan y algunos siguen en el
ARN, siendo reconocido que la función de los mismos seria regular el pasaje de
los ARN del núcleo al citoplasma. Otra función importante de los intrones es
aparentemente la de delimitar o estar entre las uniones de exones que darán
lugar a la síntesis de dominios funcionantes en las proteínas.
Este proceso de corte y empalme tiene una función biológica
muy interesante que se ha observado en la síntesis de IG. De un mismo
transcripto se pueden empalmar exones transcriptos no necesariamente contiguos.
Esto trae como consecuencia que de una sola transcripción se puedan sintetizar
proteínas diferentes con funciones diferentes. A este mecanismo se lo denomina
“empalme alternativo” (splice alternativo).
Luego de la maduración del ARNm que abandona el núcleo
representa entre el 1 y 2% de las secuencias presentes en el ADN.
La regulación de la transcripción esta dada tanto al inicio
como al final del proceso.
Nosotros conocemos que una correcta expresión de genes, en
un tiempo correcto, es el evento que dará identidad a cada célula. Como
mencionamos anteriormente, existe una secuencia de ADN denominada promotor que
determinara el sitio exacto de inicio de la transcripción para un gen
determinado y además, también los niveles de ARN. El core de los elementos que
componen el sitio promotor contiene la TATA BOX y los elementos iniciadores.
Ellos se encuentran cercanos e inmediatamente después hacia la región 5´ del
punto de inicio o sitio de iniciación de la síntesis de ARN. Casi todos los
genes tienen un nivel mínimo de transcripción que esta dado por una maquinaria
mínima de transcripción. Además la región promotora contiene sitios de
reconocimiento para factores de transcripción. Estas son secuencias especificas
en el ADN que unen proteínas. Estos sitios pueden activar (enhancer) o reprimir
(represor) la transcripción.
Los activadores desde el punto de vista funcional, parecen
ser proteínas que interaccionan con el ADN por sus dominios ácidos,
ejemplificados por residuos ricos en glutamina o prolina. Los represores son
menos conocidos desde este punto de vista, pero parece que principalmente se
encuentran en los dominios ricos en alanina.
La base de acción de estos activadores y represores, es la
interacción proteina-proteina y su consiguiente interacción con secuencias
especificas en el ADN.
Dentro de los factores de transcripción para la mayoría de
los promotores, los primeros identificados fueron los denominados TFII,
conociéndose 8 de ellos denominados: TFII A, B, C, D, E, F, G y H. Estos
factores actúan en la iniciación de la transcripción generado por la acción de
la ARN polimerasa II. Estos factores se unen en la región del promotor conocido
por secuencias ricas en A y T, llamada TATA box y guardan una secuencia
temporal de union, siendo aparentemente el TFIID el primero en interaccionar
con la región TATA, luego interaccionaría el TIFA, TFIIB y TFIIF.
La TATA box o los elementos iniciadores también son
reconocidos por un componente del TFIID denominado proteina de union de la TATA
box (TBP). Esta proteina actúa con la ARN polimerasa I y II. La TBP es un
componente integral de la maquinaria de transcripción.
Existe un grupo de proteínas que actúan junto al TBP y se
denomina TAF. Se postula que los activadores se unen secuencialmente en el
tiempo para activar la transcripción vía la interacción con el TBP y los
factores asociados a TBPs o TAFs.
Existen otros factores llamados adaptadores, que
conceptualmente no difieren de los TAFs y actuarían sin necesidad de reconocer
el ADN, pero si al TBP como parte de los mecanismos de Activacion de la
transcripción. Dentro de estos adaptadores existe una proteina llamada CBP que se une a un factor
de transcripción CREB y es denominada CREB-binding protein. El primer
CREB-binding protein factor caracterizado fue el CREB pero luego se han caracterizado
por lo menos diez factores mas, comprobándose que estos factores pertenecen a
una familia de genes con características similares. Son los siguientes: todos
ellos pertenecen a la clase de factores
de transcripción denominados bZIP, característicos por tener entre 4 a 6
leucinas. En algunos, la histidina puede reemplazar a la leucina. Estos
factores pueden heterodimizarse, pueden sufrir cambios por splicing y pueden
actuar como activadores o represores. Estos factores contienen sitios de
fosforilación para PK A, C y quinasa de caseína. Estos sitios una vez
fosforilados pueden regular la actividad de CREB. Estos factores pueden ser
regulados a través de la Activacion de PKA dependiente de AMPc.
Otra familia de factores es la denominada CREM, que tiene
un papel muy importante en la rta nuclear al AMPc y tiene mucha importancia en
la fisiología neuroendocrina.
Después de la transcripción de ADN en ARN, este ultimo es
procesado antes de salir del núcleo. En este proceso las regiones que no
codifican (los intrones) desaparecen. De esta forma solamente la información
contenida en los codones de los exones es usada para formar la secuencia
aminoacidica. Después que los intrones son eliminados continua el proceso de
maduración del ARN pasa la citoplasma para ser traducido en proteina.
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